Il Polo GGB ospita i seguenti progetti di ricerca finanziati dalla Regione Umbria (P.O.R. Umbria FSE 2007-2013):
Sviluppo di una matrice multiplex PCR-LCR per l’identificazione delle specie batteriche che causano sepsi e dei geni coinvolti nello sviluppo della resistenza agli antibiotici
Assegnista: Dott.ssa Melissa Guazzaroni

Tutor: Dott. Angelo Manzoni

Il progetto ha l’obiettivo di sviluppare e validare un sistema Point-Of-Care (POC), basato su tecnologia microarray, per la diagnosi precoce della sepsi. La sepsi è una sindrome clinica caratterizzata da un’abnorme Risposta Infiammatoria Sistemica (SIRS) che si manifesta in seguito al passaggio di microrganismi o elementi di questi nel circolo sanguigno. È una patologia che si sviluppa prevalentemente in pazienti critici immunodepressi ed è una condizione potenzialmente molto grave, che può progredire fino allo shock settico, con la manifestazione della Sindrome da Disfunzione Multiorgano (MODS) e, nei casi più gravi, può portare addirittura alla morte. Questo progetto nasce dall’esigenza di sviluppare un adeguato sistema diagnostico che superi i limiti operativi dei saggi esistenti (i lunghi tempi di esecuzione, l’impiego di procedure complesse e gli alti costi) e sia in grado di identificare rapidamente gli agenti microbiologici responsabili della sepsi batterica nei pazienti e di rilevare, allo stesso tempo, la presenza di geni di resistenza agli antibiotici. Il sistema Point-Of-Care (POC) proposto in questo progetto prevede la messa a punto di un saggio diagnostico che usa come substrato microarray (matrici), dove decine di sonde possono essere distribuite su superfici ridotte permettendo di rilevare la specie batterica patogena responsabile dell’infiammazione settica e la sua eventuale resistenza agli antibiotici. I ceppi batterici selezionati come più rappresentativi dell’infezione settica sono Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae. Le sonde per l’identificazione batterica verranno disegnate mediante amplificazione PCR-LCR a partire da regioni altamente variabili del gene 16S RNA di ciascun ceppo. Le sonde per la resistenza agli antibiotici verranno disegnate sulla base della sequenza geniche che maggiormente conferiscono resistenza agli antibiotici, come meticillina, ampicillina e cefalosporine.

Studio della risposta cellulo-mediata nei confronti di vaccini antinfluenzali “universali”
Assegnista: Dott.ssa Michela Basileo

Tutor: Prof. Antonio Cassone

Il progetto ha la finalità di caratterizzare, in modelli animali sperimentali, la risposta cellulo-mediata indotta da alcuni costrutti potenziali costituenti di un vaccino influenzale di tipo universale. I vaccini antinfluenzali attualmente in commercio sono in grado di prevenire o contenere la diffusione dei virus epidemici solo quando i ceppi inseriti nella composizione vaccinale sono strettamente correlati con quelli circolanti ma non sono in grado di prevenire l’emergenza di nuovi ceppi pandemici né tantomeno di proteggere la popolazione contro tale nuova evenienza. Ciò e dovuto alla ben nota, particolare e non prevedibile variabilità antigenica dei virus influenzali, e rende necessario somministrare annualmente gli attuali vaccini influenzali la cui composizione antigenica viene continuamente aggiornata. La loro efficacia inoltre può variare in rapporto al grado di corrispondenza fra le caratteristiche antigeniche dei ceppi vaccinali e di quelli circolanti. Una possibile soluzione a questi problemi è quella di mettere a punto vaccini diretti verso costituenti virali più conservati, non interessati da continui cambiamenti antigenici e presenti in tutti o molti differenti tipi di virus influenzali. In base alle attuali conoscenze esistono diversi bersagli virali interessanti per la messa a punto di vaccini antinfluenzali universali tra i quali la parte altamente conservata della subunità HA2 della proteina emoagglutinina (HA) e il dominio esterno della proteina M2 (M2e). L’interesse nella generazione di vaccini universali basati sulla HA2 e sulla M2e risiede nel fatto che 1) la HA2 presenta regioni altamente conservate con numerosi epitopi comuni a virus influenzali appartenenti anche a diversi gruppi filogenetici e 2) la M2e risulta quasi del tutto invariata in tutti i ceppi epidemici umani.

In conclusione, con il presente progetto ci si aspetta di conoscere tipo ed entità delle risposte cellulo-mediate, valutate sia in termini di attivazione e differenziamento di linfociti T, sia in termini di patterns di citochine rilevanti per dette risposte, nei confronti degli antigeni influenzali scelti come possibili candidati di vaccini universali. La loro caratterizzazione infatti, insieme alla valutazione del grado di protezione dall’infezione e della risposta anticorpale verso gli stessi antigeni darà informazioni rilevanti per l’importanza delle risposte cellulo-mediate ai fini dell’induzione e persistenza della memoria immunitaria, e del suo ruolo nella protezione contro l’influenza in animali immunizzati con vaccino universale.

Le attività di questo progetto, che è parte di un progetto di ricerca più ampio dal titolo “Vaccino antinfluenzale universale – UNIFLUVAC” coordinato dall’Istituto Superiore di Sanità saranno possibili grazie alla strumentazione ed al know-how messi a disposizione dal Polo d’Innovazione di Genomica, Genetica e Biologia, in qualità di soggetto ospitante.

Sviluppo di un saggio immunologico multiplo Point-of-Care per il monitoraggio della copertura vaccinale
Assegnista: Dott.ssa Giulia Morsella

Tutor: Dott. Angelo Manzoni

Il progetto di ricerca si propone di sviluppare e validare un saggio immunologico Point-of-Care (POC) per la stima simultanea della copertura vaccinale per Epatite B, Morbillo, Parotite, Poliomielite, Rosolia, Febbre gialla e Tetano. Il dispositivo POC proposto, rappresenta una valida alternativa agli attuali saggi immunologici ed offre uno strumento innovativo per valutare l’efficienza dei programmi di vaccinazione, soprattutto nei paesi in via di sviluppo, dove il tasso di mortalità infantile per mancata vaccinazione, entro i primi cinque anni di vita, è ancora altissimo. L’innovatività del saggio consiste nella combinazione delle tecnologie impiegate, grazie alle quali è possibile abbattere i costi relativi alla strumentazione ed al personale specializzato. Il punto di forza del POC risiede nella rapidità dei risultati, che in termini pratici si traduce nella possibilità di individuare in breve tempo e con bassi costi, la mancata copertura vaccinale e, quindi, di intervenire tempestivamente al fine di ottenere un’efficace immunizzazione.

Il dispositivo di saggio, combina la tecnologia lateral-flow ad un saggio immunologico ed è caratterizzato dalle seguenti componenti principali: a) sample pad, sul quale viene depositato il campione di sangue in cui deve essere rilevata la presenza di anticorpi indicatori della copertura vaccinale e sul quale sono immobilizzati gli antigeni vaccinali, coniugati a particelle di oro colloidale e immunoglobuline IgG di topo anche esse oro-coniugate; b) membrana di nitrocellulosa contenente sette bande Test (T), ciascuna per ogni vaccino, ed una banda di Controllo (C). La banda T è assorbita con reagenti per la determinazione di IgG anti-antigeni vaccinali, mentre la banda C è adsorbita con IgG di capra anti-topo; c) adsorbent pad, posto all’estremità opposta del sample pad, che direziona per capillarità il flusso del campione di sangue e delle immunoglobuline IgG di topo oro-coniugate (Fig.1).

L’esecuzione del test è estremamente semplice e richiede una minima quantità di sangue,  ottenuta con una puntura al dito, da posizionare in una apposita cella del device. La reazione di saggio viene innescata da un movimento di scorrimento del dispositivo che provoca la rottura delle capsule interne e il rilascio del tampone di flusso, il quale scorrendo lungo la strip, consente il contatto tra gli anticorpi presenti nel sangue testato e gli antigeni vaccinali immobilizzati nel dispositivo. Il legame tra anticorpi presenti nel sangue e componenti vaccinali è visibile attraverso la colorazione della banda T, conferma della presenza di anticorpi indicatori della copertura vaccinale. La mancata colorazione della banda T, è segno del mancato legame tra anticorpo e componente vaccinale e quindi, dell’assenza della copertura vaccinale. La corretta funzionalità del test è assicurata dalla banda C, la cui colorazione conferma l’avvenuto flusso lungo il dispositivo.

L’attività di ricerca si articola in varie fasi riguardanti la progettazione e l’allestimento del dispositivo di saggio, la verifica della stabilità dei reagenti alle condizioni ambientali di elevata temperatura ed umidità dei paesi in via di sviluppo cui è principalmente destinato; la validazione della tecnica lateral-flow applicata al saggio immunologico proposto e la validazione clinica del dispositivo ottenuto.

Le attività inerenti il progetto di ricerca e la realizzazione del dispositivo di saggio saranno possibili grazie alla strumentazione ed al know-how messi a disposizione dal Polo d’Innovazione di Genomica, Genetica e Biologia (GGB), in qualità di soggetto ospitante.

Il principio della sicurezza alimentare e la sua tutela nell’ordinamento nazionale, internazionale e comunitario
Assegnista: Dott.ssa Letizia Cinti

Tutor: Dott. Angelo Manzoni

 

Obiettivo del progetto è un’analisi in chiave comparativa della normativa applicabile alla qualità e alla sicurezza alimentare, con particolare riguardo alle produzioni di qualità (DOP, IGP, STG) e con un focus specifico sull’olio extra vergine di oliva.

Dall’analisi critica del quadro giuridico di riferimento applicabile al settore della food safety nonché del suo sistema di governance ci si attende la capacità di verificare l’adeguatezza degli strumenti giuridici vigenti nonché la formulazione di proposte concrete volte a rimuovere gli ostacoli che si frappongono per una più completa tutela del settore agroalimentare umbro.

Anzitutto, lo studio prende le mosse dalle principali fonti del diritto alimentare, dalle legislazioni dei principali Stati interessati dall’export agroalimentare umbro nonché dai principali e più rilevanti case studies, ponendo attenzione alle decisioni dei tribunali nazionali ed internazionali ed alle eventuali modifiche introdotte da tali sentenze nei rispetti ordinamenti.

Dopodiché, i dati ricavati sono posti a verifica attraverso un’indagine condotta tra i consumatori e le imprese interessate, per comprendere se ed eventualmente in quale misura gli strumenti giuridici vigenti soddisfino le esigenze degli stakeholders coinvolti.

A conclusione dello studio ci si attende l’elaborazione di soluzioni per l’ingresso, il riconoscimento ed il rafforzamento delle produzioni umbre nei nuovi mercati, valorizzando il contributo che le biotecnologie possono apportare al settore dell’agroalimentare in termini di costruzione di nuovi modelli di tracciabilità, etichettatura ed eventualmente certificazione della qualità degli alimenti. Crescente è infatti in questo settore la necessità di fornire agli enti di controllo strumenti per individuare eventuali frodi e sofisticazioni alimentari, alle aziende servizi per migliorare la produzione nel rispetto delle procedure di autocontrollo e di qualità, ai consumatori informazioni chiare e facilmente fruibili per essere garantiti e consapevoli al momento dell’acquisto.

Messa a punto di prototipi di test diagnostici molecolari rapidi per patogeni delle api su piattaforma NALF (Nucleic Acid Lateral Flow) tramite sistema di rilevazione con nanoparticelle di oro colloidale
Assegnista: Dott. Adriano Ragni

Tutor: Dott. Claudio Lorenzetti

 

Il progetto prevede lo sviluppo di test diagnostici basati sulla tecnologia NALF per la determinazione dei seguenti patogeni delle api: Virus delle ali deformi (Deformed Wing Virus – DWV), Virus israeliano della paralisi acuta (Israeli Acute Paralysis Virus – IAPV) e il microsporidio Nosema (Nosema ceranae).

Tra le malattie delle api, le virosi e la nosemiasi sono molto diffuse e possono causare gravi perdite economiche tuttavia sono sottovalutate dagli operatori del settore. Il rilevamento e la diagnosi degli agenti causali nei primi momenti della loro diffusione ha grande importanza per gestire la patologia, per orientare le misure di terapia e profilassi. Per la maggior parte delle virosi e delle Nosemiasi i sintomi sono solitamente generici per questo motivo è sempre necessario confermare la diagnosi fatta in campo ricorrendo alle analisi di un laboratorio specializzato.

Lo sviluppo delle nanotecnologie ha fornito nuovi strumenti per la realizzazione di metodi di rilevamento utilizzabili nella diagnostica. Le nanotecnologie si basano sullo sviluppo di materiali e dispositivi che hanno dimensioni dell’ordine del nanometro (tra 1 e 100 nm). Molti materiali prodotti su scala nanometrica possiedono caratteristiche fisico-chimiche che possono essere sfruttate per la realizzazione di dispositivi tecnologici. Le nanoparticelle possono essere impiegate anche nel settore della diagnostica perché, se coniugate ad opportune molecole di interesse (funzionalizzate) esse possono essere rilevate con grande sensibilità e precisione, possono cioè essere sfruttate come sistema di marcatura. Un esempio, strettamente attinente al presente progetto, è quello delle nanoparticelle di oro colloidale (Gold Nano Particles, GNP), che possono essere funzionalizzate ed utilizzate, grazie alle loro particolari proprietà ottiche, per rilevare molecole di interesse.

Con questa tecnologia recentemente sono stati messo a punto test diagnostici commerciali definiti NALF (Nucleic Acid Lateral Flow), questi sono dei test Lateral Flow basati sulla rilevazione del DNA anziché di un antigene specifico.

La scelta di realizzare dei saggi di tipo NALF per le malattie delle api deriva dalla necessità di ottenere la sensibilità e la specificità di un test molecolare, tramite un dispositivo rapido, economico, utilizzabile in laboratori poco attrezzati e da personale tecnico ordinario. Tali dispositivi nome potranno essere utilizzati anche direttamente in prossimità dell’allevamento (test di tipo POC, Point Of Care). Un kit POC per test molecolari dovrebbe prevedere la realizzazione di tutti i passaggi, dall’estrazione del DNA, all’amplificazione al saggio al di fuori del laboratorio.

Il progetto intende sviluppare un metodo di estrazione rapido di acidi nucleici (DNA ed RNA) da api che non comporti l’uso di strumentazione specifica di laboratorio.

DNA e RNA dei patogeni saranno amplificati tramite reazioni isotermiche mediante protocolli LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) in presenza di almeno un primer coniugato a nanoparticelle d’oro colloidale.

Il prodotto della reazione isotermica sarà evidenziato in pochi minuti tramite un dispositivo a flusso laterale opportunamente predisposto per rilevare l’amplicone legato alle nano particelle d’oro collidale.

I test NALF consentono una rapida e accurata diagnosi con prestazioni comparabili ai sistemi di indagine diagnoistica biomolecolare presenti presso i laboratori di riferimento.

I nuovi test per le patologie delle api (DWV, IAPV e Nosema) permetteranno lo svincolo delle indagini di diagnosi molecolare dalle strutture di laboratorio e del relativo personale altamente specializzato.

I destinatari di tali test innovativi potranno essere operatori istituzionali quali ASL e Istituti Zooprofilattici Sperimentali, laboratori di analisi privati, tecnici apistici, associazioni di apicoltori e le aziende apistiche grandi e medie.

Il presente progetto oltre alla realizzazione dei primi prototipi permetterà anche di gettare le basi per lo sviluppo di altri test NALF per altre malattie infettive delle api contribuendo alla gestione efficace e tempestiva delle patologie, per orientare le misure di terapia e profilassi e questo avrà ricadute positive per l’apicoltura Umbra e non solo.

Il progetto inoltre, nel contesto socio-economico di riferimento, rappresenta un’iniziativa di raccordo tra istituti di ricerca pubblica, quali gli Istituti Zooprofilattici, operanti sul territorio e aziende come RAPID Biotech e il Polo di Genomica Genetica e Biologia, per una attività di ricerca e sviluppo finalizzata alla messa a punto di prodotti innovativi.

Sviluppo di un test molecolare rapido su piattaforma cromatografica (NALF, Nucleic Acid Lateral Flow) per gli agenti delle enteropatie suine
Assegnista: Dott.ssa Francesca Tabarrini

Tutor: Dott. Claudio Lorenzetti

Regione Umbria. Por Umbria FSE 2007 – 2013. Avviso pubblico per l’assegnazione di Aiuti individuali per la realizzazione di Progetti di Ricerca. Titolo progetto: “Sviluppo di un test molecolare rapido su piattaforma cromatografica (NALF, Nucleic Acid Lateral Flow) per gli agenti delle enteropatie suine”.

Il progetto ha la finalità di sviluppare un saggio diagnostico rapido per l’identificazione degli agenti eziologici delle enteropatie suine. Il kit diagnostico è stato progettato per i patogeni  Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium e Lawsonia intracellularis. Nell’ambito delle enteropatie batteriche del suino, il poter disporre di una diagnosi eziologica rapida consente di ottenere terapie antimicrobiche più mirate, riducendo l’uso improprio di antibiotici e l’insorgenza di antibiotico resistenza.

In termini tecnologici il saggio è altamente innovativo in quanto mette insieme la consolidata tecnologia dei saggi cromatografici rapidi lateral flow (LF) con la possibilità di individuare la presenza di ampliconi ottenuti da regioni target del DNA. Questo tipo di test di nuova generazione sono definiti NALF (Nucleic Acid Lateral Flow). Il DNA utilizzato per l’analisi diagnostica viene estratto da campioni fecali attraverso una metodica semplificata e adattata alle condizioni di campo.

Uno dei vantaggi di questi test diagnostici è la rapidità, infatti, in due ore circa si arriva alla realizzazione di tutti i passaggi, dall’estrazione del DNA, all’amplificazione, quindi alla visualizzazione finale del segnale. I NALF sono di semplice utilizzo, quindi alla portata anche di operatori con un livello di specializzazione non elevato e di un laboratorio con una attrezzatura dal costo minimo, in questo modo è possibile raggiungere un numero maggiore di destinatari.

I NALF che saranno realizzati nel progetto, grazie all’implementazione della tecnica di amplificazione isotermica (LAMP) forniranno un ulteriore vantaggio perché non richiedono l’uso di costosi dispositivi come i termociclatori. Quest’ultima caratteristica consentirebbe l’uso del saggio al di fuori dei laboratori di biologia molecolare.

Saggi di questo tipo sono una novità nel mercato dei prodotti diagnostici e hanno enormi potenzialità perché possono essere adattati a nuovi target attraverso l’individuazione di regioni specifiche e la progettazione di inneschi (oligonucleotidi) altamente specifici per le reazioni di amplificazione.

Nel corso del progetto renderanno inoltre possibile fornire un sevizio di sviluppo di nuovi test on-demand.

Monitoraggio simultaneo di micotossine mediante test immunulogici su piattaforma cromatografica
Assegnista: Dott.ssa Valentina Gori

Tutor: Dott. Claudio Lorenzetti

Le micotossine rappresentano un gruppo eterogeneo di sostanze chimiche, a basso peso molecolare, prodotte dal metabolismo secondario dei miceti, che generalmente entrano nella filiera alimentare attraverso colture contaminate destinate alla produzione di alimenti e mangimi, principalmente di cereali. La loro vasta diffusione, le conseguenze economiche e per la salute umana ed animale che la loro presenza comporta hanno reso indispensabile lo sviluppo di metodologie sempre più rapide ed efficaci per la loro diagnosi.

L’idea progettuale proposta cerca di rispondere all’esigenza delle aziende operanti nel settore agro-alimentare di poter rilevare la presenza di tali micotossine in modo rapido, semplice ed efficace.

Il progetto si pone come obbiettivo intermedio quello di sviluppare quattro anticorpi monoclonali murini specifici per quattro tra le micotossine più diffuse, quali ocratossina A, deossinivalenolo, zearalenone e fumonisina B1,  e di impiegarli successivamente per la realizzazione di due tipologie di test immunologici su piattaforma cromatografica, che permettano di saggiare quantitativamente più analiti contemporaneamente consentendo agli operatori un notevole risparmio di tempo e riduzione dei costi.

Gli anticorpi vengono prodotti attraverso la fusione di cellule di una linea cellulare mielomatosa con cellule splenocitiche di topi immunizzati, seguita dallo screening mediante analisi Microarray e  dal sub-clonaggio degli ibridomi risultati positivi.

In seguito a purificazione dei surnatanti con tecnica FAST (Fast Protein Liquid Cromatography), gli anticorpi monoclonali ottenuti, specifici per ciascuna micotossina, verranno immobilizzati su fase solida agarosio/policrilammide per produrre colonnine immuno-cromatografiche multisettoriali e coniugati a particelle d’oro da poter fissare su strip di nitrocellulosa per realizzare un prototipo di test lateral-flow multifunzionale.

Questi test saranno infine validati mediante verifica della loro sensibilità e specificità, in comparazione a metodiche ufficiali di laboratorio quali Elisa e High-permormance liquid cromatography (HPLC).

Studio di Markers surrogati per l’identificazione del rischio infettivo
Assegnista: Dott. Matteo Puccetti

Tutor: Dott. Angelo Manzoni

Le infezioni fungine rimangono una delle principali cause di morbosità e mortalità nei pazienti affetti da emopatie maligne sottoposti a chemioterapia o trapianto di cellule staminali. L’incidenza delle infezioni da Aspergillus fumigatus si attesta attorno all’1–2% nei pazienti sottoposti a trapianto autologo e attorno a più del 10% in quelli sottoposti a trapianto allogenico. In particolare, la procedura da donatore alternativo, sia essa da cellule staminali da sangue periferico sia soprattutto da cordone ombelicale, sono a maggior rischio di infezione fungina invasiva. Le difficoltà diagnostiche, la mortalità elevata e la necessità di una terapia precoce hanno evidenziato come la profilassi farmacologica non sempre rappresenti una efficace strategia per prevenire le infezioni fungine. In questo contesto, lo studio dei polimorfismi dei recettori della reattività immune naturale, noti come Pattern Recognition Receptors (PRRs), tra i quali i Toll-like Receptors (TLRs), C-type Lectin Receptors (CLRs) ed i recettori NOD-like (NLRs) potrebbe rappresentare un approccio molto valido per la selezione dei pazienti a rischio di infezione fungina da sottoporre a profilassi. La scoperta di variazioni genetiche di queste proteine causata dal poliformismo di un singolo nucleotide ha evidenziato una correlazione stretta tra variazioni genomiche e suscettibilità ad infezioni.

In questo studio, nel protocollo di indagine, saranno inseriti pazienti ematologici sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche sia da donatore compatibile sia incompatibile per un aplotipo (aploidentico). I pazienti ed i controlli verranno selezionati tra quelli simili per fattori epidemiologici di rischio ed interesse clinico, malattia da trapianto-verso-ospite (graft-vs-host disease,GvHD) e trattamento. Le infezioni fungine saranno diagnosticate in base alla sintomatologia clinica e con indagini diagnostiche strumentali e definite con i criteri previsti dall’ EORTC/MSG.

Gli obiettivi del progetto saranno, quindi: A) Individuare polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) nei geni del sistema immunitario quali possibili nuovi criteri di rischio di infezione fungina nei pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali ematopietiche L’individuazione degli SNPs associati ad un’aumentata suscettibilità alle infezioni sarà eseguita mediante uno studio di associazione genome-wide (GWAS). I risultati ottenuti, da questa procedura su una prima popolazione di pazienti (discovery population), saranno a posteriori confermati con la determinazione del genotipo di una seconda popolazione di pazienti (replication population) in RT-PCR; B) Tipizzare donatori e riceventi per gli SNPs individuati; C) Valutare l’ assetto infiammatorio del paziente mediante la determinazione di citochine (IL-17A; IL-17F; IL-10; IFN-γ) nei supernatanti di coltura e, quando possibile, sangue, liquido di lavaggio bronchiale e/o escreato del paziente; D) Valutare l’ impatto della terapia antifungina convenzionale sull’espressione e funzionalità di PRRs, al fine di ottimizzare la profilassi antifungina in termini di riservarla ai soli pazienti ad alto rischio e con evidente vantaggio farmaco-economico; E) Sviluppare uno studio di validazione in modelli murini di infezione, atti a chiarire i meccanismi patogenetici, cellulari e  molecolari, coinvolti nella possibile correlazione tra SNPs nei geni del sistema immunitario ed aspergillosi invasiva. Verranno utilizzati differenti topi di genotipo C57BL/6 (sia ceppo selvaggio sia TLR-deficienti) di 8-10 settimane, di entrambi i sessi. Cellule dendritiche e polimorfonucleati verranno esposti ai funghi nelle diverse condizioni, per un periodo di 24 ore, prima di saggiare la produzione di citochine. I livelli di produzione verranno determinati sia mediante espressione degli mRNA specifici in real-time RT-PCR sia come attività secretoria nei sovranatanti di coltura mediante test Elisa e/o ELISPOT.

I risultati ottenuti nel replication study e la incidenza cumulativa di infezione saranno analizzati con il test di Gray. I dati funzionali saranno analizzati con il software GraphPad Prism 4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Negli studi funzionali, lo Student’s t-test ed analisi della varianza (ANOVA) saranno utilizzati per determinare la significatività statistica (P<0.05).